夾心法（SandwichELISA）分為雙抗體夾心法和雙抗原夾心法：

　　小鼠血栓素B2試劑盒中抗原的2個(gè)不同的抗原表位被兩個(gè)抗體——捕捉抗體和檢測抗體，分別結(jié)合。捕捉抗體固定于載體即酶標(biāo)板上，檢測抗體通過結(jié)合抗原進(jìn)行顯色分析。應(yīng)用于雙抗體夾心法檢測的捕捉抗體通常是單抗，偶爾有用多抗做為捕捉抗體的情況，但很少見，因?yàn)橐远嗫棺鳛椴蹲娇贵w容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)而降低特異性。檢測抗體通常為多抗，在商業(yè)化的科研試劑盒中經(jīng)常用到標(biāo)記的山羊多抗，再讓標(biāo)記的多抗與HRP標(biāo)記的親和素或者鏈霉親和素結(jié)合，然后再加HRP也就是辣根過氧化物酶的底物，通常是TMB反應(yīng)顯色，這種方法是在傳統(tǒng)的HRP酶標(biāo)記抗體的雙抗體夾心法ELISA中引入了-親和素放大系統(tǒng)。不過也有用單抗做檢測抗體的情況，尤其是在科研中。雙抗體夾心法具有高靈敏度、高專一性的優(yōu)勢，但該法只適用于有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的抗原檢測，主要用于檢測各種大分子抗原——例如在醫(yī)學(xué)檢測中測定HBsAg、HBeAg、AFP等疾病相關(guān)的，以及在科研中檢測細(xì)胞因子等。由于雙抗體夾心法特異性高，在檢測過程中有時(shí)會(huì)將樣本和酶標(biāo)抗體同時(shí)加入進(jìn)行反應(yīng)，稱為雙抗體夾心一步法，因?yàn)椴僮鲿r(shí)間短，在商業(yè)化生產(chǎn)中有很大優(yōu)勢。但雙抗體夾心一步法要特別注意ELISA中的鉤狀效應(yīng)（hookffect），因?yàn)榇藭r(shí)如果樣本中抗原含量過高會(huì)導(dǎo)致其與固相抗體和酶標(biāo)抗體均有結(jié)合而無法形成“夾心復(fù)合物"，此時(shí)測出的結(jié)果將低于實(shí)際含量甚至是陰性結(jié)果。因此，如果使用雙抗體夾心一步法測定樣本中抗原含量時(shí)要注意測量的線性范圍，另外使用高親和力的單抗也可削弱鉤狀效應(yīng)。